Sodium azide
۱ml
۰.۵cc
Triton X-114 0/5%
۲ml
۱۰cc
Glycerol10%
۰.۳۰۸g
۱.۵۴۲g
۱۵۴.۲
DTT10mM
۰.۸۵۴g
۴.۲۷g
۳۴۲.۳۰
Sucrose12/5mM
Up to 200ml Tris 10mM
مهارکننده پروتئاز۱: یک عدد قرص [۷۴]PI Cocktial در ۲۰ میلیلیتر آب مقطر استریل حل گردید.
مهارکننده پروتئاز۲: از محلول PMSF[75] ۱میلیمولار استفاده شد که در حلال آلی DMSO[76] حل شد، وزن مولکولی PMSF400 میلیمولار ۲/۱۷۴ گرم است که در ۵ میلیلیتر از DMSO حل گردید.
محلول EDTA 10 میلیمولار: وزن مولکولی EDTA 100 میلیمولار ۲/۲۹۲ گرم، درنتیجه ۴۶/۱ گرم از آن را در ۲۰ میلیلیتر آب مقطر ۲ بار تقطیر اضافه کرده و چون PH محلول اسیدی بود به وسیله NaOH آن را نرمال کرده و در نهایت حجم به ۵۰ میلیلیتر رسید.
۳-۸-۱-۳. روش کار
به رسوب (کلونی باکتری) مرحله قبل هر سویه، ۱۵ میلیلیتر بافر تخلیص اضافه کرده سپس frezz-thaw به وسیله ازت مایع و آب جوش انجام شد، این مرحله بیش از ۲۰ بار تکرار شد.
۵/۱ میلیلیتر از محلول EDTA 10 میلیمولار به محلولهای پیش اضافه گردید.
مهارکننده پروتئاز۱ نیز اضافه گردید.
در این مرحله محلول آماده سونیکاسیون شد. هر بشر را بدلیل جلوگیری از شکسته شدن از گرمای حاصله از سونیکاسیون در ظرف یخ گذاشته، آن را در دستگاه قرار دادیم. سونیکاسیون به مدت ۱ ساعت با پالس ۵۰-۴۷ دستگاه انجام گرفت.
مهارکننده پروتئاز۲ به مقدار ۵۰ لاندا به محلولهای پس از سونیکاسیون اضافه گردید.
محلولها با rpm 3000 و به مدت یک ساعت و در دمای۳- درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید.
بعد از انجام سانتریفیوژ محلول رویی برای مراحل بعدی نگهداری شد و برای صحت درستی عمل سونیکاسیون از رسوب آن لام تهیه گردید و رنگآمیزی ذیل نلسون انجام گردید.
۳-۸-۱-۴. استخراج پروتئینهای ترشحی
پس از عمل سانتریفیوژ مرحله ۳-۸، محلول رویی حاصله برای اطمینان بیشتر از عدم حضور باسیل احتمالی با فیلتر ۲/۰ میکرون فیلتر گردید.
۳-۸-۲. خالصسازی پروتئین
در این مرحله ناخالصیهای پروتئین مانند لیپیدها حذف شدند.
۳-۸-۲-۱. مواد مورد نیاز
محلول اشباع سولفات آمونیم ۷۰%، محلول PBS[77] x1، الکل ۶۰%، دستگاه سانتریفیوژ یخچالدار و کیسه دیالیز
۳-۸-۲-۱-۱. آماده سازی محلولها و مواد
محلول اشباع سولفات آمونیم ۷۰% : اصول این کار بدین صورت است که مقدار محلول اشباع سولفات آمونیم را بسته به حجم نمونههای محلول، ازفرمول زیر محاسبه می شود:
۱۰۰X=70 (sample’s volum + X)
X =مقدار سولفات آمونیم اضافه شده به هر نمونه
پس از وزن کردن سولفات آمونیم ، کم کم به آب دو بار تقطیر اضافه میگردید.
محلول PBS x1: طبق جدول زیر محلول PBS x10 آماده گردید (PH محلول خود روی ۳/۷ تنظیم می شود) و در این راستا محلول PBS x1 مورد استفاده با آب دوبار تقطیر آماده شد.
جدول۳-۳: مواد تشکیل دهنده محلول PBS x10
آخرین نظرات