رابطه ۳-۱: ۱۰۰ (EC₁/ EC₂) = شاخص پایداری غشاء
شکل ۳-۶ دستگاه ECسنج
۳-۶-۲-۳ محتوای رطوبت نسبی (RWC)
از روش بار و ویترلی^[۶۱] (۱۹۶۲) استفاده شد. ۴ برگ از هر کرت در ۵۰ درصد گل­دهی انتخاب و بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شدند. به قطعات ۲ سانتی­متری تقسیم و با دقت ۰۰۱/۰ گرم توزین گردیدند (FW). سپس این قطعات به­منظور تعیین وزن تورژسانس به مدت ۲۴ ساعت در شدت نور کم در ۱۰۰ میلی­لیتر آب مقطر قرار داده شدند و وزن اشباع آن­ها اندازه ­گیری شد (SW)، (شکل ۳-۷). در نهایت این برگ­ها به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۷۵ درجه سانتی ­گراد در آون نگهداری و سپس وزن خشک آن­ها تعیین گردید (DW). درصد رطوبت نسبی برگ با بهره گرفتن از رابطه۳-۲ محاسبه شد.
رابطه ۳-۲:%RWC=(FW-DW/SW-DW)100
شکل ۳-۷ اندازه ­گیری محتوای رطوبت نسبی برگ (RWC)
۳-۶-۲-۴ سنجش کلروفیل
مقدار کلروفیل براساس روش معرفی شده توسط آرنون^[۶۲] (۱۹۴۹) با استون ۸۰ درصد استخراج شد. میزان جذب نور توسط عصاره استخراج شده با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۶۶۳ و ۶۴۵ نانومتر تعیین گردید (شکل ۳-۸). بدین صورت که از برگ­های هر تیمار ۱/۰ گرم جدا و درون فالکون­هایی حاوی ۱۰ میلی­لیتر استون ۸۰ درصد به مدت ۴۸ ساعت غوطه­ور شدند. در این مدت فالکون­ها در مکانی بدون نور نگه­داری شدند. سپس نمونه گیاهی از محلول استون جدا و محلول باقی­مانده قرائت شد. غلظت کلروفیل از طریق روابط ۳ تا ۵ به­دست آمد. در این روابط V حجم نمونه استخراج شده و W وزن تر نمونه است (اشرف و همکاران، ۱۹۹۴).
رابطه ۳-۳: (w 1000)/v[(جذب درnm645) 69/2- (جذب در nm663) 7/12[=کلروفیل a
رابطه ۳-۴: (w 1000)/v[(جذب درnm663) 69/4- (جذب در nm645) 9/22[=کلروفیل b
رابطه ۳-۵: (w 1000)/v[(جذب درnm663) 02/8+ (جذب در nm645) 2/20[=کلروفیل کل
شکل ۳-۸ دستگاه اسپکتروفتومتر برای سنجش کلروفیل

۳-۶-۲-۵ دمای سایه انداز
به­منظور اندازه ­گیری دمای سایه­انداز جامعه گیاهی، از دستگاه دماسنج (ترمومتر) مادون قرمز استفاده شد. دمای سایه­انداز در مرحله­ گل­دهی، در بین ساعت­های ۱۱تا ۱۳ روزهای آفتابی و بدون وزش باد و سه تا چهار روز پس از آبیاری مرزعه اندازه ­گیری شد (آینه^[۶۳] و همکاران، ۲۰۰۲). در هنگام اندازه ­گیری دمای سایه­انداز، دماسنج با زاویه ۳۰ درجه نسبت به سطح افق در فاصله حدود نیم متر از سطح گیاه برای اندازه ­گیری دمای بالای سایه­انداز و نیم متر فاصله از کف سایه­انداز برای اندازه ­گیری دمای پایین سایه­انداز قرار گرفت.
۳-۶-۲-۶ عدد کلروفیل متر (SPAD)
جهت محاسبه عدد کلروفیل متر از دستگاه کلروفیل متر استفاده گردید. از هر کرت، از خطوط میانی، ۳ بوته و از هر بوته جوان­ترین برگ گسترش یافته انتخاب و از هر برگ ۳ نقطه سبزینه­ا­ی قرائت گردید (شکل ۳-۹). محل قرار گرفتن دستگاه تقریبا در فاصله دو سوم و یک سوم به ترتیب از نوک برگ و پایه­ برگ در نظر گرفته شد. از اندازه ­گیری در نور مستقیم اجتناب و تمام اندازه ­گیری­ها در ساعت ۱۲ تا ۱۴ بعد از ظهر صورت گرفت (عباسی و همکاران، ۱۳۸۸).
شکل ۳-۹ دستگاه کلروفیل­متر (SPAD) برای قرائت عدد کلروفیل
۳-۶-۲-۷ آنزیم پراکسیداز
مراحل استخراج: نیم گرم نمونه برگی فریز شده در یخچال ۸۰- درجه سانتی ­گراد در هاون چینی پودر گردید سپس مقدار ۱میلی­لیتر بافر استخراج با ترکیب: Tris ، EDTA، ساکارز و آب مقطر (۴/۷= pH) و بافرفسفات پتاسیم ۱۰ میلی­مولار (۷= pH) به آن اضافه شد. ترکیب حاضر به مدت ۳۰ دقیقه ساییده شد تا عصاره همگن و یکنواختی حاصل شود. تمامی مراحل مربوط به استخراج بایستی بر روی یخ انجام و فضای اطراف نمونه­ها با یخ، سرد نگه داشته شود (شکل ۳-۱۰ الف). سپس ترکیب حاضر به میکروتیوب منتقل و به دنبال آن در ۱۵۰۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴درجه سانتی ­گراد به مدت ۲۵ دقیقه سانترفیوژ شده، عصاره شفاف از محلول جدا شده و در یخچال ۸۰- نگه­داری شد.
فعالیت آنزیم پراکسیداز براساس روش ارائه شده توسط چانس و مهلی^[۶۴] (۱۹۵۵) انجام شد. اندازه ­گیری آنزیم از طریق اضافه نمودن ۱۰ میکرولیتر عصاره آنزیمی به ۲ میلی­لیتر محلول شامل بافر فسفات ۱۰۰ میلی­مولار (۷= pH)، آب مقطر دو بار تقطیر، پراکسید هیدروژن ۷۰ میلی­مولار محلول در فسفات پتاسیم ۱۰۰ میلی­مولار و گوئیکول ۱۰ میلی­مولار در آب مقطر دو بار تقطیر صورت پذیرفت. از محلول فوق جهت بلانک کردن دستگاه استفاده می­کنیم به­ طوری که ۲ میلی­لیتر از محلول واکنشی که فاقد عصاره آنزیمی را درون کووت دستگاه ریخته و سپس در طول موج ۴۷۰ نانومتر دستگاه اسپکتروفتومتر را صفر می­کنیم (شکل ۳-۱۰ ب و ج). سپس برای ترسیم منحنی فعالیت آنزیم پراکسیداز، ۱۰ میکرولیتر از عصاره آنزیمی را به مخلوط واکنشی اضافه نموده و منحنی پراکسیداز در مدت زمان ۱۲۰ ثانیه و بر حسب Abs/min می­ شود. روند صحیح منحنی آنزیم پراکسیداز در طول موج ۴۷۰ نانومتر به­ صورت سیر صعودی است.

شکل ۳-۱۰ از راست به چپ (الف) عصاره گیری (ب) ریختن عصاره در کووت (ج) دستگاه اسپکتروفتومتر جهت اندازه ­گیری فعالیت آنزیم
۳-۲-۶-۸ تعداد روز تا ۵۰ درصد غنچه­دهی و گل­دهی و رسیدگی فیزیولوژیک
این صفت با یادداشت برداری تعداد روزها از تاریخ کاشت تا رسیدن به ۵۰ درصد غنچه­دهی و گل­دهی و رسیدگی فیزیولوژیک اندازه ­گیری شد.
۳-۶-۳ صفات کیفی
۳-۶-۳-۱ درصد روغن دانه
از روش پیشنهادی پوریم^[۶۵] (۱۹۹۵) استفاده شد. دانه آسیاب شده به مقدار ۱ گرم توزین، در کاغذ صافی پیچیده شدند و به فالکون­های ۵۰ میلی­لیتری منتقل، سپس ۶ میلی­لیتر پترولیوم­اتر به نمونه­ها اضافه شد. فالکون­ها ۲۴ ساعت بر روی شیکر ۱۰۰ دور بر دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی ­گراد قرار گرفتند. بعد از ۲۴ ساعت پترولیوم­اتر درون فالکون تخلیه و مجدداً ۶ میلی­لیتر به آن­ها اضافه شد و دوباره به مدت ۲۴ ساعت بر روی شیکر قرار گرفتند (شکل ۳-۱۱). بعد از گذشت مدت ذکر شده نمونه برای تبخیر پترولیوم­اتر درون آون با دمای ۴۰ درجه سانتی ­گراد قرار گرفتند تا کاملا عمل تبخیر صورت پذیرد. در انتها نمونه ها وزن شده و اختلاف وزن آن با نمونه مصرفی درصد روغن را نشان می­دهد. عملکرد روغن از رابطه ۳-۸ محاسبه می­گردد.
رابطه ۳-۸: عملکرد دانه درصد روغن = عملکرد روغن
شکل ۳-۱۱ دستگاه شیکر
۳-۶-۳-۲ نیتروژن دانه و برگ
میزان نیتروژن دانه و برگ توسط کجلدال سنجیده شد. بدین منظور در مرحله­ گل­دهی کامل از ۱۰ بوته در هر کرت آخرین برگ نمو یافته جدا شد و به مدت۴۸ ساعت در آون با دمای ۱۰ درجه سانتی ­گراد قرار گرفت. سپس به منظور اندازه ­گیری نیتروژن دانه و برگ ۵/۰ گرم نمونه از دانه و برگ­های هر تیمار آسیاب و در لوله­های مخصوص آزمایش ریخته شد. سپس مقدار ۱۰-۷ میلی­لیتر اسید سولفوریک غلیظ (۹۸-۹۵) درصد به همراه یک قرص کاتالیزور به لوله­ها اضافه شد. سپس با بهره گرفتن از هیتر برقی که در مدت زمان ۲ ساعت دمای آن به تدریج به ۴۰۰ درجه سانتی ­گراد رسانده شد. پس از اتمام عملیات هضم، نمونه­ها به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند تا خنک شده و به هر یک از نمونه­ها بین ۷-۱۰میلی­لیتر آب مقطر اضافه شد. سپس بوسیله­ی دستگاه کجلدال میزان نیتروژن دانه و برگ محاسبه شد (شکل ۳-۱۲). لازم به ذکر است ۴ نمونه شاهد هم تهیه شد که قبل از اندازه ­گیری نمونه­های اصلی برای کالیبره کردن دستگاه استفاده شد (برمنر^[۶۶]، ۱۹۹۶).

شکل ۳-۱۲ اندازه ­گیری درصد نیتروژن توسط دستگاه کجلدال
۳-۶-۳-۳ محتوای بُر در گیاه
تعیین محتوی بُر در گیاه با روش رنگ­سنجی و با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر انجام شد. برای تعیین محتوای بُر در گیاه در اواسط مرحله گل­دهی، سه بوته از هر کرت انتخاب شد و در داخل آون به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۷۵ درجه سانتی ­گراد خشک شد. سپس از نمونه­های هر کرت ۵/۰ گرم برداشته و در کوره به مدت ۲ ساعت در دمای ۵۰۰ درجه سانتی ­گراد خاکسترگیری به عمل آمد. به نمونه­های خاکسترگیری شده ۱۰ میلی­لیتر اسید کلریدریک ۲/۰ نرمال اضافه شد. سپس محلول­های به دست آمده از صافی گذرانده شد و با آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلی­لیتر رسانده مشد. و این نمونه­ها آماده رنگ آمیزی گردیدند. از هر کدوم از محلول­ها نمونه یک میلی­لیتر برداشته می­ شود. و با بهره گرفتن از معرف کورکامین رنگ آمیزی شدند. در ادامه با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۴۰ نانومتر عدد نشان داده شده توسط دستگاه قرائت شد و براساس منحنی استاندارد مطابقت داده شد و غلظت بُر در ماده خشک گیاهی براساس میلی­گرم بُر در کیلوگرم ماده خشک گیاهی محاسبه ­گردید (شکل ۳-۱۳).
۳-۷ آنالیز آماری
تجزیه واریانس تمام صفات آزمایشی با بهره گرفتن از نرم افزار آماری SAS انجام شد. مقایسه میانگین­ها با آزمون حداقل اختلاف معنی­دار (LSD) در سطح احتمال خطای ۵ درصد انجام گرفت. در صورت معنی­داری اثر متقابل فاکتورها، از تفسیر اثر اصلی هر کدام از فاکتورها بطور جداگانه خودداری شد و تنها برش­دهی اثر متقابل صورت گرفت. هم­چنین صرف نظر از معنی­دار شدن یا نشدن اثر متقابل، برای مشخص شدن تیمارهای برتر، مقایسه میانگین ترکیب­های تیماری صورت گرفت. هم­چنین جهت بدست آوردن معادله­های مختلف و رسم نمودارها از نرم افزار Excell استفاده شد. لازم به ذکر است که داده ­های عملکرد، اجزا عملکرد و صفات مورفولوژیک با سه تکرار، اما داده ­های صفات فیزیولوژیک با چهار تکرار تجزیه شدند.
شکل ۳-۱۳ اندازه ­گیری غلظت بُر با روش اسپکتروفتومتری
فصل چهارم
فصل چهارم
نتایج و بحث
نتایج مطالعه حاضر نشان می­دهد که تاریخ­ کاشت دیر هنگام و مصرف بُر اثر قابل ملاحظه­ای بر عملکرد و اجزای عملکرد دارد. برای پی بردن به این موضوع، تأثیر تنش گرمای آخر فصل و روش مصرف بُر را بر صفات متخلف کلزا مورد بررسی قرار می­گیرد.
۴-۱ صفات فیزیولوژیک
۴-۱-۱ شاخص سطح برگ در ۵۰ درصد گل­دهی
شاخص سطح برگ یک معیار تقریبی از مساحت برگ­ها در واحد سطح زمین است. می­توان گفت که شاخص سطح برگ از پارامتر­های مهم در ارزیابی رشد یک جامعه گیاهی است که اندازه و پویایی آن به عوامل متعدد بستگی دارد. نتایج این پژوهش نشان داد که میزان شاخص سطح برگ کاملاً تحت تأثیر شرایط حرارتی و تغذیه­ای محیط است.
اثر تاریخ کاشت و کاربرد بُر در سطح احتمال خطای یک درصد معنی­دار بود (جدول ۴-۱). بیشترین سطح برگ مربوط به تاریخ کاشت اول با میانگین ۹۶/۳ و کمترین سطح برگ مربوط به تاریخ کاشت چهارم با میانگین۰۲/۲ بدست آمد (شکل ۴-۱). در مورد کاربرد بُر بیشترین عدد با میانگین ۷۳/۳ از مصرف بُر به­ صورت خاک کاربرد و کمترین عدد با میانگین ۴۶/۲ از عدم مصرف بُر حاصل گردید (شکل ۴-۲).
دما یکی از عوامل مهم در رشد، توسعه و دوام سطح برگ­ها، است (مدحج و فتحی، ۱۳۸۷). در گندم کاهش سطح برگ در تاریخ­ کاشت تأخیری می ­تواند یکی از دلایل کاهش عملکرد باشد، زیرا در فاصله زمانی قبل و بعد از گل­دهی، وجود شاخص سطح برگ پایین باعث کاهش تولید ماده خشک کل و عملکرد دانه می­ شود (رادمهر، ۱۳۷۶). تأخیر در کاشت و افزایش میانگین دما در فصل رشد باعث کاهش طول مراحل نمو از جمله دوره آغازش برگ می­ شود، لذا تعداد برگ­ها و اندازه­ آنها کاهش می­یابد (هی و واکر، ۱۳۸۳).
در توصیف دلیل افزایش شاخص سطح برگ در اثر کاربرد عنصر بُر باید گفت که بُر باعث تولید بیشتر کلروفیل در برگ­های گیاه، افزایش فتوسنتز و در نتیجه افزایش سطح سبز برگ می شود (ویتش^[۶۷] و همکاران، ۱۹۹۷). کاربرد مقدار مناسب بُر از طریق اثر بر رشد و توسعه سلول­ها، تکامل و ترمیم آوندها و بهبود سیستم انتقال مواد (متشرع­زاده و ملکوتی، ۱۳۷۸) منجر به ایجاد سطح برگ بیشتر در کلزا شده است. ژو^[۶۸] و همکاران (۱۹۹۸) در نتایج آزمایشات خود با کاربرد بُر ارتفاع متوسط بالاتر و سطح برگ بیشتر گیاه را در مراحل ابتدایی و انتهایی گیاهچه گزارش نمودند.