۲۰ میلیگرم
اسیدنیکوتینیک
۵ میلیگرم
میواینوزیتول
۱۰۰۰ میلیگرم
۳-۱-۳- دستورالعمل تهیه یک لیتر محیط کشت MSFull
پس از افزودن ۵۰ میلی لیتر از استوک ماکرو، ۱۰ میلی‌لیتر از استوک‌های میکرو I، آهن، ویتامین و ۱ میلی‌لیتر استوک میکرو II به همراه ۳۰ گرم ساکارز و پس از اضافه نمودن آب مقطر به حجم حدود ۹۸۰ میلی‌لیتر رسید، pH معادل ۶/۵ تا ۸/۵ تنظیم شد و سپس مقدار ۷ گرم آگار به این مجموعه اضافه و حجم نهایی به ۱۰۰۰ میلی‌لیتر رسانیده شد پس از اختلاط کامل مواد بر روی هیتراستیرر محیط آماده شده جهت استرلیزاسیون به اتوکلاو انتقال یافت.
۳-۱-۴-استریل کردن بذور
به منظور انجام ضد عفونی سطحی ابتدا بذور به مدت ۲۴ ساعت زیر آب جاری قرار داده شدند. سپس بوسیله الکل ۷۰% به مدت ۱ دقیقه و محلول هیپوکلریدسدیم ۵/۲% به مدت ۲۰ دقیقه ضد عفونی گردید سپس چندین بار با آب مقطر استریل کاملاً شستشو داده شدند.
۳-۱-۵- محیط کشت جوانه زنی
جهت جوانهزنی از محیط کشت MSFull استفاده شد. پس از تهیه محیط کشت MSFull این محیط به زیر هود منتقل و در زیر هود در داخل پتریهای ۸ سانتیمتر توزیع شد.
پس از سرد شدن و انعقاد محیطها، بذرهای استریل به داخل پتریها منتقل شدند. سپس بوسیله پارافیلم اطراف پتریها کاملاً بسته شد و به داخل دستگاه ژرمیناتور با دمای انتقال یافتند.
بعد ازگذشت ۴ روز بذرها جوانه زده و بعد از گذشت ۲۰ روز از کاشت بذرها گیاهچههای تازه جوانهزده آماده برای تهیه ریزنمونه ایجاد شد.
۳-۱-۶- مرحله کالزایی
در فاز کالزائی از دو ریزنمونه برگ و ریشه استفاده شد. تعداد ۵ ریزنمونه در هر ظرف کشت قرار داده شد و برای هر تیمار (ترکیب هورمون و ریزنمونه) سه تکرار در نظر گرفته شد. سپس نمونه های کشت شده برای کالزائی به اتاقک رشد انتقال یافت تا در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد و فتوپریود ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی فرایند تمایززدایی صورت گیرد. کالزائی نمونه ها حدوداً پس از گذشت ۳۰ روز از کشت ریزنمونهها قابل مشاهده بود بطوریکه بعد از ۵ هفته تقریباً تمام ظروف دارای کالوس شده بودند. کلیه مراحل اجرای این بخش در آزمایشگاه کشت بافت دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه انجام شد.
جدول ۳-۸: ترکیبات هورمونی مورد استفاده در کالزایی
Hormone combination
۲,۴-D
IAA Kin
Media code
۱
۰/۱ ۰
۱
۰/۸
۰/۱ ۰
۲
۲/۵
۰/۰۱ ۰
۳
آخرین نظرات